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代写硕士论文摘要:为探讨适合枸杞棉蚜基因组DNA提取的方法,采用9种方法提取枸杞棉蚜基因组DNA,并对每种方法提取的DNA样本质量进行综合比较分析。结果表明,改进十二烷基硫酸钠(SDS)法、优化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、盐析法均可从枸杞棉蚜中提取总DNA,浓度高且所制备出的DNA均可成功应用于mtDNA CO[QX(Y15]Ⅰ[QX)]基因扩增。STE粗提法、Chelex精提法、饱和NaCl法Ⅱ提取的枸杞棉蚜基因组DNA质量低,不能满足分析要求。改进SDS法及STE精提法所制备的DNA质量较佳、产量较高、实用性强,是值得推广应用的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。盐析法提取DNA,试剂成本低、毒性小,是一种安全有效的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。Chelex粗提法是一种快速的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。 关键词:枸杞;棉蚜;基因组DNA;提取方法 枸杞棉蚜(Aphis gossypii Glover)属同翅目(Hompotera)蚜科(Aphididae)蚜属(Aphis),是我国西北地区栽培枸杞(Licium barbarum L.)分布地的主要害虫,短期内可暴发成灾,引起枸杞果产量和品质严重下降[1]。棉蚜具有明显的生物型[2-3],如棉花型和黄瓜型[4-5],而枸杞棉蚜属于何种生物型亟待验证。确定昆虫的生物型,不仅需要采用传统的生物学特征和生态学参数比较[4,6-7],而且需要分子遗传学数据佐证[2,7-8]。 单头枸杞棉蚜基因组DNA提取是开展枸杞棉蚜分子遗传学研究的前提与基础[9]。由于枸杞棉蚜体型微小,体表有外骨骼,其DNA提取有一定难度。Black等通过十二烷基硫酸钠(SDS)方法提取蚜虫基因组DNA,并通过随机扩增多态性DNA-PCR(RAPD-PCR)检测蚜虫多态性[10];龚鹏等在棉蚜DNA的提取中采用STE精提法,用简单重复序列PCR(SSR-PCR)技术研究了棉花和木槿上棉蚜的多态性[11];安瑞生等对KAc法、SDS法的研磨步骤进行了改进[12-13];张帆对改进后的KAc法中加入蛋白酶K进行了优化,并用 mtDNA-CO[QX(Y15]Ⅰ[QX)]技术研究了棉花型、黄瓜型棉蚜的多态性[14]。目前,国内最常用的2种棉蚜基因组DNA提取方法为改进SDS法和优化KAc法。国外棉蚜基因组DNA提取常采用SDS法[2,8],以及Chelex粗提法[7,15]。 為筛选出适合枸杞上棉蚜基因组DNA的提取方法,本研究借鉴国内外应用较多的提取蚜虫DNA的8种方法对其稍作改进,即改进SDS法、优化KAc法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、盐析法、饱和NaCl法Ⅱ、STE粗提法、Chelex粗提法、STE精提法,并参照Chelex粗提法自创了Chelex精提法,对这9种方法提取的基因组DNA的质量、DNA提取所需时间、操作难易程度和所用试剂的毒性大小进行综合比较,为进一步开展枸杞棉蚜遗传结构分析奠定基础。 1材料与方法 1.1试验材料 于2015年7-8月在青海诺木洪枸杞主产区蚜虫发生较重的栽培枸杞田,采集无翅蚜虫成虫,每株枸杞采集1头试虫,每头试虫所在植株至少间隔5 m,样品单头分别放于盛有无水乙醇的1.5 mL离心管中浸泡,于4 ℃低温采样箱内保存,带回实验室后,于-40 ℃超低温冰箱保存备用。试验时随机抽取。 1.2基因组DNA的提取方法 改进SDS法:参照杨子祥等的改进SDS法[16],稍作改进。具体方法:将单头蚜虫在双蒸水中漂洗,滤纸吸干后转入1.5 mL离心管中,加入100 μL匀浆液(按A液 ∶[KG-*3]B液 ∶[KG-*3]C液体积比25 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2配制。其中A液:Tris-HCl 10 mol/L,NaCl 01 mol/L,EDTA 1 mol/L,pH值为8.0;B液:10% SDS;C液:蛋白酶K 10 mg/mL)。用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨。并用500 μL匀浆液冲洗研磨棒,56 ℃水浴4 h(若裂解液未透明,水浴时间延长至8 h),其间摇匀3~4次。加入600 μL Tris饱和酚,在摇床上缓慢摇匀20 min后,7 000 r/min 离心10 min,取上清液。加入600 μL三氯甲烷 ∶[KG-*3]异戊醇(体积比为24 ∶[KG-*3]1),在摇床上缓慢摇匀20 min后,7 000 r/min 离心 10 min,取上清液。加入600 μL无水乙醇(-20 ℃预处理),混匀,-20 ℃冰箱内放置1 h以上。12 000 r/min 离心 10 min,弃去上清液。加入600 μL 70%乙醇(-7 ℃预处理),12 000 r/min离心10 min,弃去上清液。自然干燥后,加入20 μL ddH2O溶解,-20 ℃保存。 优化KAc法:参照张帆的优化KAc法[14]。 STE粗提法:参照Gomi等的STE粗提法[17],挑取蚜虫方法同改进SDS法中的挑取方法,加入20 μL STE缓冲液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH值为8.0),用玻璃研磨棒研磨,加入1.6 μL蛋白酶K(10 mg/mL);简单离心后,37 ℃孵育30 min;95 ℃初始变性5 min;简单离心后,-20 ℃保存。 Chelex粗提法:参照Carletto等的Chelex粗提法[7,15],蚜虫在0.65%(质量分数)NaCl溶液中洗2次;将蚜虫放入 1.5 mL 离心管中,管内放有55 μL 5%(质量分数)Chelex树脂溶液,用玻璃研磨棒研磨;56 ℃水浴30 min,在100 ℃水浴7 min;5 000 r/min离心1 min,取上清液,-20 ℃保存。 STE精提法:参照龚鹏等的STE精提法[11],在STE粗提法的基础上进行改进,挑取单头蚜虫置于1.5 mL离心管内分别加入200 μL STE缓冲液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH值为8.0),用玻璃研磨棒研磨,分别向离心管内再加入500 μL匀浆液、1.6 μL蛋白酶K(10 mg/mL),56 ℃水浴4 h;剩余步驟参照改进SDS法进行酚-三氯甲烷抽提,无水乙醇沉淀DNA,溶解保存。 Chelex精提法:在Chelex粗提法的基础上进行改进,蚜虫在0.65%(质量分数)NaCl溶液中洗2次;将蚜虫放入 1.5 mL 离心管中,管内放有100 μL 5%(质量体积比)Chelex树脂溶液,研磨;分别向离心管内再加入500 μL匀浆液、2 μL蛋白酶K(10 mg/mL),56 ℃水浴4 h;剩余步骤参照改进SDS法进行酚-三氯甲烷抽提,无水乙醇沉淀DNA,溶解保存。 CTAB法:参照韩玉翠等的CTAB法[18],稍作改进。具体步骤如下:挑取蚜虫于离心管中,加入50 μL CTAB 缓冲液[2%CTAB,0.1 mol/L Tris-HCl(pH值为8.0),0.02 mol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,0.2% β-巯基乙醇],用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨。并用150 μL CTAB缓冲液冲洗研磨棒;65 ℃水浴1 h;取出后加入1 U RNA酶,置于37 ℃温箱中1 h;取出后加入500 μL三氯甲烷-异戊醇(体积比为 24 ∶[KG-*3]1),缓慢摇动混匀,13 000~15 000 r/min离心15 min;取上清液(约 150 μL),加入2倍体积的冰无水乙醇,约1/10体积NaAc(3 mol/L,pH值为5.2),混匀后置于-20 ℃ 3 h以上;13 000 r/min 离心15 min,弃上清液,用70%乙醇(-20 ℃ 预处理)清洗2次;室温干燥,加入20 μL TE缓冲液溶解,于-20 ℃ 保存。 盐析法:参照Sunnucks等的盐析法[19],稍作改进。具体步骤如下:挑取蚜虫于离心管中,加入20 μL TNES提取缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH值为7.5,400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,0.5% SDS),用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨,并用200 μL TNES冲洗研磨棒;再加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL),轻摇混匀,于60 ℃水浴1 h(中间取出摇匀1次);加入80 μL 5 mol/L NaCl,用力摇动15 s,4 ℃、14 000 r/min 离心5 min,取上清液;加入300 μL预冷的无水乙醇轻轻混匀,-20 ℃放置30 min;4 ℃、14 000 r/min离心 5 min,弃上清液;加入300 μL 75%乙醇(-20 ℃预处理)洗涤,4 ℃、14 000 r/min离心5 min,弃上清液;在室温下干燥,然后加20 μL灭菌ddH2O,充分溶解后-20 ℃保存备用。 饱和NaCl法Ⅱ:参照马丽滨等挑取蚂蚁的饱和NaCl法Ⅱ[20]。 1.3基因组DNA纯度及浓度检测 对9种方法提取的DNA浓度和纯度进行检测。用Biowave DNA型蛋白核酸分析仪测定DNA纯度和浓度。纯度由D260 nm/D280 nm值确定,该值介于1.7~1.9之间时DNA纯度较好,以测量值为参数确定DNA浓度。 1.4基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测 采用1%琼脂糖凝胶(添加了0.01% GoldView I型核酸染色剂)电泳,将8.0 μL DNA、2 μL 6×Loading Buffer混匀后上样,电泳条件为140 V,30 min,经Gel Doc凝胶成像系统(购自美国BIO-RAD公司)照相和分析。DNA的条带无拖尾、无RNA污染,点样孔无酚、蛋白质残留,可用于mt-DNA CO[QX(Y15]Ⅰ[QX)]扩增研究。 1.5PCR 扩增及检测 参照张帆使用的棉蚜CO[QX(Y15]Ⅰ[QX)]引物[14],上游引物为CAL:5′-TAATAACGAACAGGAACAG-3′,下游引物为CAR:5′-TAGTTGCTGATGAAGTAG-3′,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增体系为50 μL:25μL Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye),1 μL上游引物,1 μL下游引物,1 μL DNA,22 μL ddH2O。扩增程序为94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性1 min,50 ℃退火50 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃终延伸10 min。PCR产物于-20 ℃保存。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶(添加了0.01% GoldView I型核酸染色剂)电泳检测(140 V,30 min),上样量为每孔 10 μL,经Gel Doc凝胶成像系统照相和分析。其中CO[QX(Y15]Ⅰ[QX)]基因在电泳中检测到目标片段后,将40 μL扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序,以PCR引物为测序引物,在ABI3730测序仪上进行正向测序。 2结果与分析 2.1基因组DNA纯度及浓度检测 通过9种方法提取单头枸杞蚜虫样品,检测DNA的浓度和纯度,如表1所示,改进SDS法、STE精提法、Chelex粗提法提取DNA样品浓度的平均值分别为264.33、225.00、256.67 ng/mL,D260 nm/D280 nm 平均值分别为1.73、1.84、1.73,均为高质量DNA;CTAB法、盐析法、饱和NaCl法Ⅱ提取DNA样品浓度的平均值分别为316.67、456.67、216.67 ng/mL,D260 nm/D280 nm平均值分别为1.94、1.94、1.90,可见DNA中有少量RNA的污染;Chelex精提法提取DNA样品浓度的平均值为36.67 ng/mL,D260 nm/D280 nm平均值为213,说明DNA中有大量RNA的污染,DNA浓度过低;优化KAc法提取DNA样品浓度的平均值为318.33 ng/mL,D260 nm/D280 nm平均值为1.63,说明DNA中有蛋白质或酚的污染;STE粗提法提取DNA样品浓度的平均值为834.67 ng/mL,D260 nm/D280 nm平均值为146,说明DNA中有大量蛋白质或酚的污染。 综上所述,在时间充裕并要求提取高产量、高质量的DNA情况下,提取枸杞棉蚜DNA建议选用改进SDS法、STE精提法;在要求减少对试验人员毒害的前提下,建议选用盐析法,此方法在安全性及时间方面优于改进SDS法、STE精提法;在时间紧促情况下,建议选用Chelex粗提法,该方法操作简单,耗时最少,Chelex-100使用手册上指出该法所获得DNA模板保存时间较短,应在1周内使用。因此,可以根据试验目的、试验成本等情况综合考虑,选取合适的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。 参考文献:[HJ1.7mm] [1]郭蕊. 柴达木枸杞蚜虫生物学特性及种群生态学研究[D]. 西宁:青海大学,2012:57-61. [2]Komazaki S,Toda S,Shigehara T,et al. The genetic structure of Aphis gossypii populations in Japanese fruit orchards[J]. Entomologia Experimentalis Et Applicata,2011,140(2):171-179.
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